摘要目的：探讨卵胞浆内单精子注射（ICSI）操作中，降低聚乙烯吡咯烷酮（PVP）浓度对ICSI效果的影响。方法：将132例160个周期接受ICSI治疗的患者所获1549个MⅡ卵随机1∶1分配，分别采用在含7％和3.5％PVP（对有A、B级活动精子的周期）或者在3.5％和不含PVP（对仅有C、D级活动精子的周期）操作液中制动的精子行ICSI，比较ICSI效果。结果：PVP浓度为3.5％时，ICSI卵的受精率和卵裂率分别为80.12％和96.78％，与PVP浓度为7％时的受精率（79.84％）和卵裂率（96.89％）比较差异无显著性（P＞0.05），但采用3.5％PVP制动精子行ICSI获得的优质胚胎率达77.76％，高于7％PVP制动时的71.43％，差异有显著性（P＜0.05）。在不含PVP操作液中制动精子后行ICSI，卵子的受精率、卵裂率及优质胚胎率均与在3.5％PVP制动精子行ICSI差异无显著性（P＞0.05）。结论：对于活动力良好的精子，降低精子制动液的PVP浓度至3.5％，可提高ICSI的优质胚胎率。精子活动力差时，进一步降低PVP浓度对ICSI效果无明显影响。

　　关键词：受精，体外；胚胎移植；精子制动；聚乙烯吡咯烷酮

　　卵胞浆内单精子注射（intracytoplasmicsperminjection，ICSI）前，制动精子以损伤精子尾部、增加精子膜渗透性，对其进入卵细胞后成功地激活卵是必需的［1］。为了使精子制动过程易于进行，通常采用10％聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone，PVP）增加操作液的黏性来降低精子的运动速度［2］。这种情况下行ICSI，PVP不可避免地会随制动后的精子注入卵胞浆内。尽管PVP具有优良的溶解性、生物相溶性和生理惰性，但仍有潜在不良影响［3－4］。减少和消除PVP的不良作用，成为改善ICSI操作条件的趋势。我们采用自身对照研究，探讨ICSI操作中不同程度地降低PVP浓度对于ICSI效果的影响。

　　1对象与方法

　　1.1研究对象2007年6月至2008年4月在本院因男方少、弱精症，梗阻性无精，或前次常规体外受精失败（不受精或受精率低于30％）接受ICSI治疗的132例不育患者共160个周期纳入研究。患者年龄（30.2±4.4）岁，不育年限（4.7±1.9）年。每个周期所获MⅡ卵随机1∶1分配，分别在不同浓度PVP微滴中制动后进行ICSI。

　　1.2方法

　　1.2.1超促排卵及卵子回收采用长方案，于前次月经周期黄体中期开始皮下注射达必佳（decapetyl，Ferring）0.1mg隔日1次。于月经第3天开始肌注基因重组FSH（Gonal-F，Serono）150～225IU／d，B超监测卵泡生长情况。至主导卵泡直径达16～18mm时，肌注HCG10000IU，36～38h后经阴道穿刺取卵。

　　1.2.2卵母细胞准备将卵冠丘复合体置于含10％人血白蛋白（humanserumalbumin，HSA）的人输卵管液［Quinn′sAdvantageTMFertilization（HTF）Medium］，37℃、5.0％CO2条件下培养2～4h，用透明质酸酶（hyaluronidase80U／mLinHEPES-HTF）消化，毛细管吹吸法去除颗粒细胞，获得显微注射用裸卵。

　　1.2.3精子准备射出精子用梯度离心液（PureceptionTM80％lowerphasegradient，PureceptionTM40％upperphasegradient）处理。经皮附睾穿刺获得的精子，采用HTF直接孵育。

　　1.2.4ICSI操作皿准备将7％PVP（ART-4005，readytousesolution）用HEPES1∶1稀释，获得3.5％PVP液。用Falcon1006培养皿准备两种ICSI操作皿：皿1供有A、B级活动精子的周期用，皿中央为3.5％和7％PVP各2个微滴，周围为HEPES微滴，用组织培养用油（oilfortissueculture）覆盖所有液滴。皿2供仅有C级活动精子的周期用，中央为0％（不含PVP的HEPES）和3.5％PVP各2个微滴，其余同皿1。

　　1.2.5精子制动和ICSI过程在显微操作仪（NikonTE300／Hoffman／Narishige，日本）上进行。显微固定针和注射针采用HumagenMPH-MED-35，MIC-35-35。将精子加入含不同浓度PVP的微滴中（精子10～20条／HP）。仔细观察位于操作盘底部的精子，尽量选择形态正常、活动力好的精子进行制动。注射针置于精子尾部中点，下压、水平快速拉过尾部制动，将制动成功（精子不动且尾部出现一明显折痕时）的精子从尾部吸入注射针。待穿刺的卵置于HEPES液滴中。固定针于3点处将卵固定，将极体置于5～6点或12～1点处。将装有已制动精子的注射针于9点处刺入透明带及卵细胞膜，回吸部分卵胞浆后，将回吸的胞浆、精子和尽量少的PVP注入卵胞浆，缓慢退出注射针。已注射的卵转移至并在含10％HSA的HTF液中充分洗涤，再移入卵裂培养基（Quinn′sAdvantageTMCleavageMedium）微滴中，在37°C、5％CO2和适宜湿度条件下培养。

　　1.2.6受精及胚胎情况观察显微注射16～18h后观察受精情况。出现2PN为正常受精。受精卵继续培养，ICSI后64～66h后观察，参考Veeck标准进行胚胎评级［5］。Ⅰ级：胚胎卵裂球等大，形态规则，无碎片。Ⅱ级：胚胎卵裂球大小轻微不均，形态欠规则，碎片＜20％。Ⅲ级：胚胎卵裂球不均，碎片20％～50％。Ⅳ级：胚胎卵裂球不均，碎片＞50％。其中Ⅰ和Ⅱ级视为优质胚胎，选择细胞数＞5的优质胚胎1～3个移植。

　　1.2.7统计学处理利用SPSS10.0软件，采用χ2检验对数据进行分析。P＜0.05视为有统计学差异。

　　2结果

　　有A或B级活动精子可用的周期137个，分别有659和645个卵在7％和3.5％PVP中制动后行ICSI。在两种浓度PVP操作液中制动精子，ICSI卵的受精率和卵裂率差异无显著性，但优质胚胎率在采用3.5％PVP制动精子行ICSI者增高，差异有显著性（P＜0.05），见表1。

　　仅有C级活动精子可用的周期23个，分别有125和120个卵在3.5％PVP和不含PVP的HEPES液中制动后行ICSI。ICSI卵的受精率、卵裂率和优质胚胎率差异均无显著性（P＞0.05），见表2。

　　3讨论

　　ICSI是人为地把精子直接注入卵细胞内，回避了自然受精对异常精子或卵子的选择等环节。ICSI操作中环境改变或机械和化学接触不可避免对卵母细胞造成一定程度的损害，所以ICSI治疗的安全性尤其为人们所关注［2］。其中，精子制动后外源性物质PVP的引入，具有干扰精子核的解凝等潜在影响［3］。避免使用任何外源性物质是最理想的条件，但一般若不降低精子运动速度，不利于准确快速地对精子进行形态观察和选择，将进一步对ICSI产生不良影响。在操作液中添加PVP，不仅利于选择精子，也使精子制动易于进行，有助于精子在注射针内顺畅移动，方便操作。ICSI时，将注射入卵胞浆内的液体量减至最小后，降低所采用的PVP浓度是减少PVP不良影响的有效办法之一。赵晓娥等［6］对山羊卵母细胞行ICSI的研究发现，正常卵裂率、桑葚胚率和囊胚率随PVP浓度的下降而上升。采用5％PVP的操作液制动精子，ICSI所得胚胎发育优于PVP浓度为10％和8％者。Wei等［7］报道，降低PVP的浓度可提高受精率，但考虑到操作时的难度，建议采用PVP浓度不低于4％。在ICSI实践中，我们曾尝试在不含PVP的操作液中制动精子，但是快速运动的精子形态观察的准确性下降，操作时间相对于在PVP中延长。因此，为尽量减少PVP的不良影响同时又不影响操作方便，本研究将本中心常规采用的目前所用的PVP浓度自7％降低至3.5％。研究发现，在3.5％PVP中制动精子后行ICSI，操作难度无明显增加，并可获得与在7％PVP中相似的受精率和卵裂率，且优质胚胎率更高。这可能与降低PVP浓度使注入细胞的PVP量减少、同时又未影响快速操作有关。我们在不含PVP或含3.5％PVP操作液中对活动力差的精子进行选择和制动，发现精子的形态观察和操作难易程度相当，ICSI后卵受精率、卵裂率和优质胚胎率效果差异无显著性，提示3.5％PVP随ICSI过程注入卵母细胞后，并未对ICSI效果产生明显不良影响。  鉴于本研究中采用自身对照、平衡了卵子质量可能引起的ICSI效果差异；此外，精子均采用活动精子（活动力A、B、C级），因而排除了精子活动力差别可能产生的影响［8］。我们认为，将制动精子时常规采用的PVP浓度降低至3.5％，对具有活动力良好的精子行ICSI而言，可提高优质胚胎率；对于活动力差的精子，采用3.5％PVP虽然对ICSI效果无明显影响，但较不用PVP制动，操作更方便。